校对生命之书基因编辑更安全

科学的进步就像一个探险家通过一个未知的丛林徘徊。通常情况下，密集的灌木丛似乎难以穿透，但在某些特权时刻，一片空地打开，一个全新的景观出现。

这样的事情发生在生物学领域，最近发现了干预生命遗传密码的强大技术。用计算机的剪切和粘贴功能轻松编辑基因的新方法可能比原子的分裂更重要，并且代表了对致命疾病的战争的重大进展。这一突破 - 被称为CRISPR - 受到了欣喜若狂的乐观和严重的忧虑。

在Nature Communications杂志的高级在线版中出现的研究中，Karen Andersen，Samira Kiani和他们在亚利桑那州立大学的同事描述了一种基因编辑工具CRISPR-Cas9“免疫沉默”的方法，可能允许编辑和修复基因要可靠而狡猾地完成。

该研究首次准确预测了负责Cas9蛋白免疫识别的显性结合位点或表位，并实验性地将其靶向修饰。这些发现使CRISPR更接近安全的临床应用。

Anderson是Biodesign Virginia G. Piper个性化诊断中心和ASU生命科学学院的教授。她还是亚利桑那州梅奥诊所的医学副教授。除了在亚利桑那州立大学生命科学学院和生物与健康系统工程学院任命之外，Kiani最近加入了生物设计研究所。她的研究兴趣包括使用合成生物学方法来提高CRISPR的安全性。

古代工具，未来科学

早在1987年，日本大阪的一个研究小组发现了一些奇特的东西。相同的遗传序列似乎在大肠杆菌的细菌基因组中重复出现。这些回文序列通过缩写的不同组成的DNA片段分开。

这些奇怪的重复序列的性质和分离它们的奇怪的DNA短语是一个谜。值得注意的是，他们开始出现在其他细菌中。实际上，这种现象似乎无处不在，并且正在进行解释的竞争。

今天我们知道研究人员偶然发现了一种以前未知的细菌免疫系统 - CRISPR(用于聚集的规则间隔短回文重复序列)。

CRISPR依赖于两个主要组成部分。第一种被称为指导RNA，是一种分子猎犬，负责定位待修饰或禁用的基因组中的特定位点。第二种成分，称为Cas9，是一种特殊类型的蛋白质，称为内切核酸酶。它的功能类似于一对锋利的修枝剪，在指导RNA所需的位置切割双链DNA。

当大肠杆菌等细菌被一种不熟悉的病毒(称为噬菌体)侵入时，CRISPR系统就会被激活。如果细菌防御机制成功地使病毒失效，则CRISPR将入侵者的DNA切成片并将这些片段存储在一种基因组文库中。随后对细菌的病毒攻击将导致CRISPR将有害病毒的DNA片段与来自先前病毒攻击的细菌DNA片段数据库进行比较。当引导RNA在病毒DNA上找到匹配时，它与互补序列结合，Cas9蛋白质切断DNA，终止病毒。

自然2.0

聪明的研究人员很快就认识到CRISPR-Cas9作为通用基因编辑工具的潜力，不仅可用于修饰整个细菌基因组中的选定区域，还可用于所有生物体(包括人类)的基因组。可能性是惊人的，并不仅限于对广泛的遗传疾病的有效治疗。有史以来第一次，有可能纠正大自然的遗传错综复杂，彻底治愈许多这些疾病，并防止其他疾病的发生。

CRISPR还具有从根本上改变生态系统的潜力，并被建议通过驱动携带它们灭绝的蚊子，通过称为基因驱动的CRISPR辅助技术消灭疟疾等疾病。

在地球历史上第一次，一个物种掌握着指导其自身进化过程的关键(更不用说细菌，长颈鹿，红木树和所有行星生命的进化)。目前，禁止人类的基因编辑工作可以通过种系传递给后代，但至少在一种情况下，这些边界已被不明确地超越。如此强大和多功能的CRISPR方法，可能很少有应用生物学的领域，它将保持不受影响。

但在CRISPR可以在临床上采取其第一步试验步骤之前，必须解决许多安全问题，从基因切片蛋白Cas9开始。

“作为一项技术革命的社会革命，许多研究人员已经开始研究与CRISPR使用相关的伦理，社会，安全和监管方面的考虑，”Kiani说。“解决CRISPR治疗的可控性，特异性和副作用的安全工程获得了巨大的动力，并且出现了道德辩论以确保正确使用技术。我的实验室有兴趣解决这两个问题。”

管理免疫力

Cas9是一种精确且通用的工具，可用快速，廉价且致命的切割设备取代早期，不准确和低效的基因编辑技术。但是天然形式的Cas9可能不被人体良好耐受。

使CRISPR技术安全用于临床使用是一个核心问题，而且这个问题具有挑战性。一个必要条件是确保CRISPR的中心机制不被患者的免疫系统识别为外来实体并受到攻击。这种免疫反应可能导致严重的毒性。(早期的，在CRISPR之前引入改变的基因以纠正罕见的遗传疾病的方法导致了免疫系统反叛导致多器官衰竭和死亡的悲剧。今天，改进的基因治疗载体已经导致对一系列遗传的更安全的治疗尽管这些干预措施的“脱靶”效应仍然是一个重要问题。)

Cas9蛋白来源于普通细菌化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。“这个问题，”安德森说，“我们中的许多人已经对链球菌有免疫力。如果您患有A组链球菌感染，您可能已经预先存在对该蛋白质的免疫力。”

化脓性链球菌是一种圆形细菌，通常定植于咽喉，生殖器粘膜，直肠和皮肤，每年在全世界影响7亿人。它是由风湿热和风湿性心脏病，猩红热和链球菌性咽炎(俗称链球菌性咽喉炎)引起的疾病。

在先前的基因编辑工作中，从人体组织中取出细胞，重新设计并在体内替换。CRISPR的强大功能使研究人员能够修改活体组织内的DNA，甚至可以通过单一CRISPR干预来靶向多种基因修饰。“如果你想考虑修复器官中的细胞，如肝细胞，肾脏或大脑，”安德森说，“那么你必须在那里表达细菌蛋白质。”这就是触发对Cas9的免疫反应的威胁成为一个难以克服的障碍。

Cas9隐姓埋名

这项新研究证实Cas9在人类中确实具有免疫原性，并且预先存在化脓性链球菌可以驱使身体的T细胞发动针对细菌蛋白的免疫攻击。当筛选出143份血液样本时，其中82份(或57.3%)显示出可检测到的化脓性链球菌抗体水平。

该研究接下来描述了生产适用于基因编辑的Cas9的全功能版本的努力，其不被免疫系统识别和靶向。为此，研究人员确定了抗体结合Cas9分子的区域(称为表位)，这些区域直接涉及触发T细胞识别和攻击。

将Cas9表位的所谓锚定残基中的两个突变单独地和组合地进行研究以评估它们对免疫原性的影响。仅通过一种氨基酸修饰这些区域就产生了可以在卧底操作的Cas9版本。T细胞对突变肽的反应性显示减少25-30倍，同时使Cas9的DNA切割能力保持完整。