狂犬病病毒单克隆抗体设计和评价

一、概述

狂犬病是由狂犬病病毒感染所致的一种动物源性传染病，病死率几乎100%，据原卫计委统计数据，近15年我国狂犬病年发病死亡人数在600~3300例。2004-2014年，狂犬病死亡人数一直高居我国传染病死亡数的前3位[1]。全国年暴露人口数逾4000万，接种疫苗人数为1500万左右[2]，是我国重要的公共卫生威胁。

根据我国《狂犬病预防控制技术指南（2016年版）》[3]，目前对已经出现疾病症状的狂犬病没有公认有效的治疗方法，只能预防。在我国，暴露后免疫比暴露前预防的成本效益更高,成为主要的预防方式。暴露后立刻给予有效的狂犬病疫苗和抗体，能够使人体产生对狂犬病的免疫力。世界卫生组织（WHO）狂犬病专家咨询委员会建议[4, 5]，对于狂犬病病毒III级暴露者，应在接种疫苗的同时对伤口进行彻底清洗并在周围浸润注射被动免疫制剂，即人狂犬病免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG）或马源抗狂犬病血清（Equine rabies antiserum，ERA），以阻止病毒进入神经组织从而获得快速保护作用。对于免疫功能严重低下的暴露者，即使II 级暴露，也应联用被动免疫制剂。被动免疫制剂的机制为在第一针疫苗注射后至机体产生足量抗体之前的窗口期提供即时的免疫保护。但上述被动免疫制剂供应量有限，价格偏高，有血清病类过敏反应和血源传播疾病的潜在风险。

狂犬病单克隆抗体因批间效价差异小、安全性提高、可大量制备等优势，有替代HRIG、ERA的潜力，成为该领域的研发热点[6]。目前国际上已有数家公司投入到基因工程重组抗狂犬病毒单抗的研发领域：印度血清研究所开发的SII RMab于2016年在印度获批上市；荷兰Crucell公司、印度Zydus研究中心以及中国兴盟生物科技、中国华北制药的相关产品均已进入II、III期临床研究。

西欧、加拿大、美国、日本等发达国家因在动物免疫、管理方面的重视，已基本消除了犬狂犬病，在这些国家狂犬病通常被列为罕见病。而99%的人间狂犬病发生在发展中国家，中国狂犬病发病仅次于疫情最严重的印度，狂犬病治疗用药在我国有广大的目标人群，因此新药临床试验的实施及评价不应与欧美日等发达国家标准完全一致。由于狂犬病一旦发病，临床结局为死亡，作为被动免疫预防性用药临床试验有诸多安全风险和伦理问题，在新药临床试验设计时应对研究人群、用法用量、研究主要终点、联合用药、研究周期等慎重考虑。本文对狂犬病病毒单克隆抗体新药临床试验设计和评价重点关注问题进行了讨论分析。

二、临床试验的重点考虑

（一）受试者

1.早期和探索性试验受试者选择

由于狂犬病临床结局的特殊性，其预防用药的有效性也是安全性评价的重要组成部分。出于伦理和临床研发考虑，早期和探索性试验建议选择无狂犬病暴露、无接种史的健康受试者。同时，由于早期试验以抗体滴度为疗效指标，健康志愿者也能满足疗效观察的需求。

2.确证性试验受试者选择

在确证性试验阶段，应考虑受试者与临床实际用药人群的一致性。狂犬病单克隆抗体出于暴露后免疫（PEP）的研发目的，应选择狂犬病毒暴露且需要应用被动免疫制剂者，其暴露定义应符合当前学术界共识。参考当前狂犬病防控技术指南设定和临床研发实际，建议确证性试验受试者选择免疫功能正常的III级暴露者。

具体制定受试者选择标准时，建议对暴露动物和暴露身体部位进行规定，并在试验中记录具体情况。犬是我国狂犬病的主要传染源，其次是猫，占95％以上，狐、狼、豺、鼬獾、貉、臭鼬、浣熊、猫鼬和蝙蝠等是狂犬病的自然储存宿主，可感染狂犬病病毒成为传染源。暴露于蝙蝠均属于III 级暴露。禽类、鱼类、昆虫类、爬行类（如蜥蜴、蛇、 龟鳖）等不感染和传播狂犬病，啮齿类和兔形目极少感染狂犬病，也未发现此类可分为导致人间狂犬病的证据。

狂犬病潜伏期长短与病毒的毒力、侵入部位的神经分布等因素相关，病毒数量越多、毒力越强、侵入部位神经越丰富、越靠近中枢神经系统，潜伏期越短[4, 5]。头面部、手指、手臂、会阴部等神经终板丰富的部位暴露比其他部位暴露，多处暴露比单处暴露更高危。在募集受试者时，建议尽可能控制创面的大小、深度等，因外伤的复杂程度不同，暴露者还可能患严重并发症以及继发的细菌感染，应保证组间研究基线一致。

对全部咬伤暴露人群的动物进行病毒学检测确定高危人群的难度较大，可在临床研究中对一定比例的感染源进行病毒学检测。狂犬病潜伏期无任何诊断方法，因此无需对受试者进行病毒学检测。

被动免疫制剂应尽早使用，最好在伤口清洗完成后立刻开始。疫苗应用7 天后其主动免疫应答反应已经出现，此时再使用被动免疫制剂意义不大（见图）。临床试验中，为获得理想状态和结果，应对暴露后被动免疫时机进行规定，建议一般为24小时之内。

图. 狂犬病被动免疫作用机制简图[3, 7]

根据WHO的统计数据，40%被狂犬咬伤者为15岁以下的儿童。因此鼓励在新药研究中纳入儿童受试者为临床用于儿童提供依据，建议在确证成人应用的安全有效性之后，再考虑儿童的试验研究。

完成免疫功能正常暴露人群研究后，在有证据可以预测新药可能在免疫功能抑制者、合并HIV感染者、肝肾功能失代偿者等人群中的安全有效性的情况下，才可进行相应人群的临床试验。

（二）终点指标

因研究药物为狂犬病预防性用药，一旦发病临床结局为死亡，因此以疾病的转归和结局作为唯一主要研究终点存在困难和伦理问题，可以选择与理想主要终点最相关的疗效指标作为临床试验的主要评价指标。

1.血清学指标

一般选择狂犬病毒中和抗体（Rabies Virus Neutralizing Abs，RVNA）监测免疫效果。WHO推荐抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test，RFFIT）和小鼠脑内中和试验（Mouse Neutralization Test，MNT），RFFIT 方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。目前，被动免疫尚无RVNA有效阈值水平的推荐。对于狂犬病疫苗，WHO认为狂犬病中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml时，接种者才具备有效的保护能力。美国免疫接种咨询委员会（ACIP）推荐抗体有效水平为RFFIT法血浆稀释5倍,即0.1IU/mL。考虑到新药研发为预防性目的，一种剂量需覆盖所有病毒株、各病毒暴露水平、各类人群，结合推荐RVNA水平推算过程，可以考虑以WHO推荐的RVNA≥0.5IU/ml作为临床试验中被动免疫有效水平。但应注意到狂犬病单克隆抗体为伤口局部和全身中和作用，血清抗体水平是替代药效学指标，且与疫苗联用时测得RVNA是单克隆抗体与疫苗主动免疫的叠加效果。建议进一步进行研究并采集数据，以更进一步支持血清学指标的科学性与合理性。